Automatisierte Flüssig-Flüssig-Extraktion

Es gibt analytische Methoden, die seit Jahrzehnten funktionie-ren und die dennoch unter gewissen Voraussetzung eine Her-ausforderung darstellen. Die Flüssig-Flüssig-Extraktion (Liquid-Liquid-Extraction, LLE) ist eine davon. Ihr Trennprinzip ist leicht erklärt, ebenso seine praktische Umsetzung: Ein Analyt verteilt sich gemäß seiner relativen Löslichkeit zwischen zwei nicht mischbaren Phasen, üblicherweise einer wässrigen Matrix und einem organischen Lösungsmittel. Weniger einfach, dafür deut-lich aufwendiger sind die Schritte, die darauffolgen; ein jeder birgt die Möglichkeit, Fehler in den Prozess einzutragen, die sich am Ende also solche im Messergebnis nicht erkennen las-sen. Will sagen: Ein erheblicher Anteil der Gesamtmessunsi-cherheit in der chemischen Analytik entsteht nicht im Messsys-tem, sondern davor. Automatisierung löst dieses Problem nicht, indem es die Chemie vereinfacht. Automatisierung schafft eine bessere Prozesskontrolle. Zur Veranschaulichung des Sach-verhalts wollen wir uns vier konkrete Anwendungen anschauen, und zwar aus den Bereichen Veterinärmedizin und forensischer Toxikologie sowie der Lebensmittelsicherheit und -kontrolle, mit denen sich das GERSTEL-Applikationslabor beschäftigt hat. Die Applikationen unterscheiden sich methodisch, führt ihre Betrachtung zu demselben Befund.

Fall 1: Ketamin im Pferdeserum – wenn neun Schritte zu einem Workflow werden [1]

Das manuelle LLE-Protokoll zur Bestimmung von Ketamin in biologischen Matrices ist neunstufig: Alkalisierung der Probe mit Kalilauge, Zugabe eines MTBE/Dichlormethan-Gemisches (7:3 v/v), fünfminütiges Vortexmischen bei 2000 U/min, Zentrifugati-on, Überführung der organischen Phase in ein sauberes Gefäß, Eindampfung bei 40 °C, Rekonstitution in einer wässrig-methanolischen Formiatlösung, Filtration, Injektion in das LC-MS/MS-System. Jeder dieser Schritte erweist sich im manuel-len Betrieb als potenzielle Fehlerquelle.

Die Übertragung dieses Protokolls in eine automatisierte Prep Sequence auf eine GERSTEL MPS Dual Head WorkStation mit mVORX-Mischmodul, mVAP-Verdampfungsstation und Filtrati-onsoption lieferte über vier Replikate hinweg einen Variations-koeffizienten von 0,467 % bei einer Wiederfindung von 88,7 %. Drei Replikate der reinen Standardlösung streuten mit einem CV von 0,182 %. Die automatisierte Extraktion aus der komple-xen biologischen Matrix ist damit kaum weniger präzise als die direkte Standardmessung. Das ist ein Resultat, das manuell allenfalls unter kontrollierten Laborbedingungen erreichbar wä-re, mutmaßlich jedoch nicht im Routinebetrieb.

Dieselbe Workstation erlaubt zusätzlich das automatisierte Me-thodenscreening. Für die Bestimmung von Buprenorphin und Norbuprenorphin in bovinem Plasma wurden vier Extraktions-mittel unterschiedlicher Polarität – Hexan/IPA (99:1), Methyl-tert-butylether, Methylenchlorid, Ethylacetat – mit drei pH-Bedingungen (sauer, neutral, basisch) systematisch kombiniert und ausgewertet. Das Ergebnis: Hexan/IPA unter sauren Be-dingungen lieferte die besten Wiederfindungsraten für beide Analyten. Das Screening verlief vom Laborpersonal unbeauf-sichtigt; Ergebnisse lagen am nächsten Morgen vor. Was ma-nuell Wochen dauern würde, war hier eine Frage von Stunden.

Fall 2: Bisphenol A in Getränken – wenn der Grenz-wert die Methode überholt [2]

Im April 2023 senkte die Europäische Behörde für Lebensmit-telsicherheit (European Food Safety Authority, EFSA) den tole-rierbaren täglichen Aufnahmewert für Bisphenol A um den Fak-tor 20.000, und zwar auf 0,2 ng/kg Körpergewicht pro Tag. Für einen 60 Kilogramm schweren Erwachsenen entspricht das einer tolerierbaren Tageszufuhr von 12 ng. Unter der verein-fachten Annahme einer Getränkeaufnahme von einem Liter täglich wäre dieser Wert bei einer BPA-Konzentration von 12 ng/L erreicht. Die etablierte AOAC-Referenzmethode (Official Method 2017.15) arbeitet mit einem validierten LOQ von 300 ng/L – einem Wert, der die regulatorisch relevante Konzentrati-on um mehr als den Faktor 25 überschreitet. Die Methode wäre für eine Expositionsabschätzung nach dem neuen EFSA-TDI schlicht nicht ausreichend sensitiv.

Die automatisierte Salting-out Assisted Liquid-Liquid Extraction (SALLE) auf einem GERSTEL MPS roboticPRO mit quickMIX-Mischmodul und CF-200-Zentrifuge schließt diese Lücke. Das Prinzip nutzt den Aussalzeffekt: Zugabe von Natriumchlorid zur wässrigen Probe verdrängt das polare Lösungsmittel Acetonitril aus der wässrigen Phase und erzwingt eine Phasentrennung. Da Acetonitril direkt LC-MS/MS-kompatibel ist, entfällt der Ein-dampfungsschritt vollständig. Das bedeutet eine Fehlerquelle weniger und ein Zeitgewinn obendrein. Vier Milliliter Probe, ein Gramm Natriumchlorid, fünf Impulsmischzyklen à 15 Sekunden bei 1500 U/min, fünf Minuten kontinuierliches Mischen, zehn Minuten Zentrifugation – fertig.

Das Ergebnis überzeugt: ein LOQ von 0,1 ng/mL, fünfmal emp-findlicher als die AOAC-Referenzmethode, ein R²-Wert von 0,997, eine mittlere Genauigkeit von 99,9 % bei einer relativen Standardabweichung (RSD) von 2,32 %, und zwar über sieben unterschiedliche Getränkematrices hinweg, angefangen bei Softdrinks über Orangensaft und Eistee bis hin zu Protein-drinks. Matrixbedingte Wiederfindungsunterschiede zwischen 89,4 % (Eistee) und 130 % (Orangensaft ohne Fruchtfleisch) spiegeln reale Ionisierungseffekte im LC-MS/MS-System wider – kein Methodenfehler, sondern ein Matrixeffekt, der durch den Einsatz eines isotopenmarkierten internen Standards (d₁₆-BPA) zuverlässig kompensiert wurde.

Fall 3: Fettsäuren in Säuglingsnahrung – wenn Se-kunden über Datenqualität entscheiden [3]

Säuglingsnahrung zählt zu den am strengsten regulierten Le-bensmitteln weltweit. Ihr Fettsäureprofil, insbesondere der Ge-halt an DHA und Arachidonsäure, ist für die neurologische Ent-wicklung in den ersten Lebensmonaten essenziell und muss analytisch zuverlässig bestimmt werden. Als Referenz dient die AOAC 2012.13, eine Transesterifizierungsmethode zur Be-stimmung von Fettsäuremethylestern (FAMEs) mittels GC-FID. Ihr kritischster Parameter ist nicht die Chemie, sondern das Timing: Die Zugabe von Hexan muss exakt 180 (±10) Sekun-den nach der Natriummethoxid-Zugabe erfolgen; die Neutralisa-tionslösung folgt 30 Sekunden später. Diese Zeitfenster deter-minieren die Reaktionskinetik der Transesterifizierung. Aus Er-fahrung gesprochen: Manuell sind sie bei mehreren parallelen Proben kaum konsistent einzuhalten.

Die automatisierte Umsetzung auf einem MPS robotic/MPS roboticPRO mit Valco-M50-Pumpenmodul und Motion-40-Agitator macht die Einhaltung dieser Zeitfenster zur Systemei-genschaft. Die MAESTRO-Software steuert jeden Zugabezeit-punkt exakt auf die Sekunde, und das Pumpenmodul dosiert die Neutralisationslösung mit 35 mL/min in definiertem Fluss. Was bei manueller Durchführung vom Laborpersonal abhängt, ist hier in die Ablauflogik eingebaut und schlussendlich unabhängig von Probenanzahl und Tagesform.

Der methodisch aufschlussreichste Befund der Optimierung war dabei kein Effizienzgewinn, sondern ein Qualitätszuwachs: Nicht maximale Agitation, sondern kontrollierte 500 U/min er-wiesen sich als optimal, während höhere Drehzahlen die Emul-sionsbildung begünstigten und die Trennung der Phasen beein-trächtigte. Automatisierung dient hier folglich nicht der Intensi-vierung des Prozesses, sondern der reproduzierbaren Einstel-lung seines methodisch geeigneten Zustands. Zwei pulverför-mige Säuglingsnahrungsproben mit 25,5 % bzw. 27,1 % Fett-gehalt erzielten mittlere Präzisionswerte von 2,86 % und 10,0 % CV. Der höhere Wert der zweiten Probe ist matrixspezifisch bedingt – und wird durch die Automatisierung sichtbar gemacht, statt durch Bedienerstreuung überlagert zu werden.

Fall 4: Xylazin und Medetomidin in Plasma und Urin – wenn Automatisierung den ganzen Weg geht [4]

Xylazin ist in den USA und Kanada als Streckmittel in Fentanyl-haltigen Straßendrogen zu einem forensischen Problem gewor-den: Die US-amerikanische Drogenbehörde DEA hat es in 48 von 50 Bundesstaaten in sichergestellten Proben nachgewie-sen. Medetomidin, ein selektiver α₂-Adrenozeptor-Agonist aus der Veterinäranästhesie, ist in Fällen von Vergiftung und Miss-brauch zunehmend forensisch relevant. Beide Verbindungen liegen in biologischen Matrices (Plasma und Urin) in konjugier-ter Form vor, was eine enzymatische Vorbehandlung vor der eigentlichen Extraktion erforderlich macht. Das erhöht die Kom-plexität des Workflows erheblich.

Die automatisierte Methode auf dem MPS roboticPRO mit quickMIX, Zentrifuge und MultiSample Evaporation Station (mVAP) bildet den gesamten Workflow ab, angefangen bei der enzymatischen Hydrolyse konjugierter Analyten mittels β-Glucuronidase (15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur), über die zweifache Extraktion mit Chloroform mit Kombination der organischen Phasen, bis zur Eindampfung des Extraktes und Rekonstitution des Rückstands in einem Ethanol-Wasser-Gemisch (1:1). Der gesamte Prozess verläuft vollautomatisch, eines manuellen Eingriffes bedarf es nicht. Die finale Injektion in das LC-MS/MS-System erfolgt ebenfalls automatisch.

Die Leistungsdaten sind für einen mehrstufigen Workflow aus biologischen Matrices bemerkenswert: LOQ 0,1 ng/mL für beide Analyten in beiden Matrices, R²-Werte ≥ 0,997, Wiederfindun-gen zwischen 88,7 % (Medetomidin in Plasma) und 115 % (Xylazin in Plasma), Präzision unter 3,6 % RSD. Für Plasma betrug die mittlere Genauigkeit 101 % für Xylazin (Bereich 87,3–104 %) und 101 % für Medetomidin (94,7–107 %); für Urin 101 % bzw. 102 %. Über isotopenmarkierte interne Standards (Xylazin-d6 und Medetomidin-¹³C-d3) wurden Matrixeffekte kompensiert. Der Mehrwert der Automatisierung spiegelt sich nicht allein in einer Präzision und dem Probendurchsatz, son-dern auch in puncto Sicherheit: Die Exposition des Laborperso-nals gegenüber organischen Lösungsmitteln und potenziell in-fektiösem Probenmaterial wird konsequent minimiert.

Was vier Anwendungen gemeinsam haben und wo-rin ihr Unterschied liegt

Veterinärpharmakologie, Lebensmittelsicherheit, Säuglingser-nährung, forensische Toxikologie – die Anwendungsfelder könnten unterschiedlicher kaum sein. Was sie verbindet, ist ein strukturell identisches Problem, nämlich eine analytisch be-währte, aber im manuellen Betrieb störanfällige Extraktions-technik, deren kritische Parameter, darunter Volumenpräzision, Mischintensität, Zeitsteuerung, Temperatur, Druck, der Abhän-gigkeit vom Bediener entzogen und in eine reproduzierbare Prozesslogik überführt werden müssen. Genau das leistet die Automatisierung.

Drei Einschränkungen verdienen dabei ausdrückliche Erwäh-nung. Erstens macht Automatisierung aus einer chemisch un-geeigneten Methode keine gute Methode: Matrixeffekte in der Detektion verschwinden nicht, weil die Dosierung präziser wird, sondern müssen durch geeignete Strategien wie die Isotopen-verdünnung separat adressiert werden. Zweitens ist Automati-sierung nicht für jede Anwendung wirtschaftlich: Bei niedrigen Probenzahlen und selten eingesetzten Methoden kann der ma-nuelle Betrieb vorteilhafter bleiben. Drittens ersetzt Automatisie-rung nicht das analytische Urteil: Lösungsmittelwahl, pH-Optimierung, Extraktionsstrategie – all das setzt chemisch-analytische Expertise voraus. Automatisierung übersetzt diese Entscheidungen in einen reproduzierbaren Prozess; sie trifft sie nicht.

Was bleibt, ist ein Befund mit einer klaren Richtung. Verschärfte Grenzwerte wie der neue EFSA-TDI für BPA, wachsende Do-kumentationspflichten nach ISO/IEC 17025, GMP und GLP sowie zunehmend komplexere Matrices machen präzise, be-dienerunabhängige und validierbare Probenvorbereitungssys-teme nicht zu einer Option, sondern zu einer methodischen Notwendigkeit. Die automatisierte LLE, vor allem in der SALLE-Variante für polare Analyten, ist dafür methodisch gut positio-niert. Aus einem handwerklich geprägten Schritt wird eine defi-nierte, steuerbare, dokumentierbare Prozesskette. Das ist kein Selbstzweck, sondern schlicht moderne Analytik.

Referenzen

[1] Foster F et al. Automating Liquid-Liquid Extractions using a Bench-top Workstation. GERSTEL AppNote 177.

[2] Foster FD, Stuff JR. Automated Salting-out Assisted Liquid-Liquid Extraction and Determination of Bisphenol A in Beverage Samples. GERSTEL AppNote 230.

[3] Foster F et al. Automated Liquid-Liquid Extraction and Determi-nation of Fatty Acids Composition in Infant Formula according to AOAC® 2012.13. GERSTEL AppNote 267.

[4] Foster FD, Harper-Kerr M. Automated Liquid-Liquid Extraction and Determination of Xylazine and Medetomidine in Plasma and Urine Samples. GERSTEL AppNote 289.